Der vorgesehene Einsatzzweck des beantragten inversen Laser Scanning Mikroskops ist die Untersuchung von dynamischen Vorgängen bei Immunzellen (Zellmigration, Adhäsion) mit sehr hoher optischer und zeitlicher Auflösung. Im Fokus stehen sensitive live cell imaging Analysen zur Aktindynamik und der Mobilisierung und Aktivität von intrazellulären Komponenten spezifischer Signaltransduktionswege mit Hilfe von Biosensoren (z. B. Calcium, Rho-GTPasen) auf Einzelzellebene.
Das beantragte Mikroskop muss hauptsächlich folgende Merkmale optimal erfüllen: 1.)hochsensitive Detektion und 2.) sehr hohe Bildaufnahmeraten. Insbesondere für live cell Applikationen ist dafür eine sehr gute Lichtsammeleffizienz notwendig, um auch bei geringen Anregungslaserleistungen (<1 %) hohe Bildraten mit einem optimalen Signal/ Rausch-Verhältnis zu erzielen.
Für die maximale Erfassung des Emissionssignals muss das Mikroskop sowohl über parallele spektrale Detektion als auch simultane spektrale Trennung verfügen.
Basisgerät für die live cell imaging Anwendungen soll ein inverses Fluoreszenzmikroskop (inkl. Hellfeld- und Differential-Interferenzkontrast) mit hochauflösender Optik sein, das mit exakt steuerbaren und z.T. automatisierten Funktionen, wie beispielsweise motorisiertem Probentisch, Mehrfachpositionen-Bildaufnahme, Autofokuskorrektur und Klimatisierung (37°C, CO2) ausgestattet ist. Für hochsensitive Detektion in z-Dimension wird ein konfokales System beantragt. Für Mehrfachfluoreszenzvisualisierung in unterschiedlichen Spektral-Bereichen werden leistungsstarke Laser mit folgenden Linien benötigt: 405, 458, 488, 514, 543 (oder 555) und 633 nm.
Das live cell imaging System soll hochsensitive Detektion bei sehr hohen Bildaufnahmeraten ermöglichen. Wir arbeiten mit empfindlichen Primärzellen mit überwiegend schwachen Fluoreszenzsignalen (z. B. schwachen Immunfluoreszenzfärbungen oder geringen Expressionsstärken von fluoreszenz-markierten Proteinen). Daher ist eine sehr gute Lichtsammeleffizienz notwendig, um mit möglichst wenig Anregungslicht effizient und probenschonend zu detektieren und sowohl Ausbleicheffekte des Fluorochroms als auch phototoxische Effekte, die das Verhalten von lebenden Zellen erheblich beeinflussen können, zu minimieren. Die Reduktion des systemeigenen Signal-Rauschens (Detektorrauschen) sollte durch optimale Gerätetechnik (gekühlte Detektoren, effiziente Signaldetektion durch optimierten Strahlengang mit minimalem Photonenverlust etc.) gewährleistet sein. Davon unbeeinflusst ist jedoch das Signalrauschen aus der Probe, dessen relativer Anteil bei schwachen Fluoreszenzen höher ist als bei einem starken Signal.
Für die geplanten live cell imaging Untersuchungen wird von uns ein sensitiver, lichteffizienter Flächendetektor mit GaAsP als photosensitivem Material als absolut notwendig erachtet. Während bei der konventionellen konfokalen Mikroskopie das Pinhole das Detektionsvolumen bestimmt, agieren beim Flächendetektor viele Detektorelemente gleichzeitig als konfokales Pinhole. Die mit diesem multiplen Verfahren erzielte Abbildung erzielt gegenüber der standardmäßigen konfokalen Detektion, mit nur einem Pinhole definierter Öffnung, ein besseres Signal/Rausch Verhältnis, da mehr Signal vom Probenpunkt zur Bildentstehung beiträgt. Besonders für live-cell Applikationen ist diese Technik besonders vorteilhaft, da die gesteigerte Sensitivität (besseres Signal/Rausch Verhältnis, S/N) genutzt werden kann, um probenschonender zu detektieren (weniger Anregungslicht ist notwendig) und gleichzeitig eine verbesserte Bildqualität und Auflösung zu erzielen. Im Gegensatz dazu kommt aus unserer Sicht ein System, das auf der sog. Dekonvolutionstechnik basiert nicht in Betracht. Dekonvulotion erzielt eine Verbesserung der Auflösung und des S/N-Verhätnisses mithilfe mathematischer Algorithmen. Grundsätzlich kann somit auch die Auflösung konfokaler Bilder gesteigert werden. Allerdings ist zu beachten, dass durch die konventionelle konfokale Detektion mithilfe eines Pinholes als Ausgangsmaterial dann weniger Signalintensitäten zur Verfügung stehen. Insbesondere bei schwachen Fluoreszenzen im live cell imaging ist die Sensitivität und Auflösung also geringer als bei der o. g. Flächendetektion.
Für das Erreichen von sehr hohen Bildaufnahmeraten bei konfokalen Systemen ist die Parallelisierung der Detektion sinnvoll. Dabei ist es wichtig, dass die erzielte Geschwindigkeit nicht mit einer Verringerung der sogenannten Pixelintegrationszeit und einer damit verbundenen Verschlechterung der Auflösung und Sensitivität einher geht. Aus diesem Grund ist ein sehr schneller Galvano-Scanner (mit der Möglichkeit der parallelisierten Detektion) in jedem Fall einem Resonanz-Scanner vorzuziehen.
Genauere technische Anforderungen werden mit der Aufforderung zur Angebotsabgabe versendet.